Next Generation Sequencing-, PCR- und Liquid Biopsy
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Die Hochdurchsatzsequenzierung der nächsten Generation ermöglicht die Sequenzierung von Millionen DNA-Fragmenten mit Erzeugung von Daten bis zu mehreren Gigabasen in inzwischen weniger als 24 Stunden. In der Molekularen Diagnostik konnte die Analyse von krankheitsrelevanten Gensätzen mit dieser Methode durch Verringerung von Zeit und Kosten entscheidend erleichtert und verbessert werden. Heute sind diese, bisher sehr aufwendigen und nur im Rahmen von großen Studien oder Forschungsserien durchgeführten molekularbiologischen Untersuchungen Teil der Routinediagnostik im molekularpathologischen Labor.
DNA-Sequenzierung ist eine Methode für die Bestimmung der Abfolge der Nukleotide in einem DNA-Strang.
Die Sequenzierung hat die biologischen und medizinischen Wissenschaften auf revolutionäre Weise vorangetrieben und das Zeitalter der Genomik eingeleitet. Was die klinische Medizin betrifft, wird die Sequenzierung zunehmend als analytische Schlüsselmethode zur Untersuchung genetisch bedingter Erkrankungen, krebsbedingte Zellveränderung oder Eigenschaften von Krankheitserregern herangezogen und ist aus einem molekularbiologischen, diagnostischen Laborbetrieb nicht mehr wegzudenken. Die Weiterentwicklung der herkömmlichen Methode nach Sanger der letzten vierzig Jahre führte in jüngster Zeit zu modernen Verfahren, die durch beschleunigte Sequenzierung anhand eines hochparallelen Einsatzes eine erhebliche Verbesserung herbeiführen. Diese zeitlich nach der Sanger-Methode entwickelten Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung werden unter dem Begriff Next Generation Sequencing (NGS) oder Massive Parallel Sequencing oder Deep Sequencing zusammengefasst.
DIE WESENTLICHEN VORTEILE DER NGS-TECHNOLOGIE IM VERGLEICH ZU HERKÖMMLICHEN VERFAHREN LASSEN SICH ANHAND VON ZWEI GESICHTSPUNKTEN DER NEUEN TECHNOLOGIE WIE FOLGT DISKUTIEREN (1):
1. Hohe Kapazität der NGS
Die Realisierung der massiven parallelen Sequenzierung von Millionen DNA-Fragmenten in einem einzigen Sequenzierlauf ermöglichen die Erzeugung von Sequenzdaten bis zu einigen Gigabasen. NGS ist durch den hohen Durchsatz deutlich kostengünstiger, schneller und qualitativ bei entsprechender Expertise der konventionellen Sanger-Sequenzierung überlegen, insbesondere auch bezüglich komplexer Genveränderungen wie z.B. Deletionen oder Duplikationen. (2) Die möglichen Anwendungen gehen noch weit über diese erwähnten Beispiele hinaus.
2. Sequenziertiefe der NGS
Neben der hohen Sequenzierkapazität, findet bei NGS darüber hinaus eine klonale Amplifikation einzelner mit Barcodes versehenden Moleküle statt. Bei der klassischen Sequenzierung nach Sanger hingegen werden Moleküle simultan, also nicht einzeln amplifiziert. Der Nachweis von Minoritäten spielt in der Tumordiagnostik eine wesentliche Rolle: Gerade in der molekularen Onkologie trifft man oft auf Mutationen mit mosaikartiger Verteilung im Gewebe oder auf geringe Materialmenge, wie z.B. bei Biopsien, oder auf Therapieverläufe, bei denen eine minimale Resterkrankung nachgewiesen werden soll. Durch die hohe Sequenziertiefe kann mit NGS hier noch eine Aussage bezüglich der relevanten Genveränderungen getroffen werden. Das kann auch der Fall sein, wenn der Anteil von Zellen, welche nicht von der Genveränderung betroffen sind, relativ hoch ist.
In der NGS -Routinediagnostik liegt unser Fokus auf der Companion Diagnostik der Entitäten NSCLC, CRC, Mamma, Melanom und GIST. Des Weiteren werden im Rahmen der in-vitro Diagnostik tumorgenetischer Veränderungen Prostata-, Endometrium-, Schilddrüsenkarzinome, Gallengangskarzinome und Pankreaskarzinome sowie andere seltene Entitäten untersucht. Alle Fusionen werden mittels Amplikon-basierten NGS Methoden detektiert und ggf. mittels FiSH überprüft.
(1) Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 2010, 11:31-46.
(2) Frampton GM et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 2013, 31: 1023-1031.
Die Untersuchungskosten für die NGS Analysen werden von allen gesetzlichen und privaten Kassen bei entsprechender Indikation übernommen.
Einsendung für die molekularpathologische Analyse mittels NGS und PCR
- Eine Analyse kann ausfolgenden Materialen erfolgen:
- FFPE-Gewebe (vorab in 4% gepuffertes Formalin fixiertes Gewebe*)
- mehrere 20 µm Leerschnitte incl. 1 HE-Schnitt (nach den 20µm)
- ungefärbte zytologische Ausstrichpräparate
- Das Material sollte einen möglichst großen Anteil an invasivem Tumor enthalten.
- Tumor mit ausgedehnten Nekrosen und/oder Einblutungen und/oder starken Blutbeimengungen (Bronchus-/Lungenbiopsien/BAL) ist nur eingeschränkt zur molekularen Diagnostik geeignet, besonders bei geringer Tumorzellzahl.
- Eine EDTA-Entkalkung beeinträchtigt die Qualität molekularer Analysen ebenfalls negativ und Gewebe nach einer Säureentkalkung (TCA) ist nicht mehr für molekulare Untersuchungen geeignet, da sowohl RNA als auch DNA irreparabel geschädigt sind.
- Hohe Temperaturen, insbesondere bei gleichzeitig starkem Vakuum (xylolfreie Einbettverfahren) beeinflussen die Qualität der DNA negativ
* Das Untersuchungsmaterial sollte immer mit 4% gepuffertem Formalin fixiert sein, da ungepuffertes Formaldehyd zu einer starken DNA-Degradation führt.
Bitte beachten Sie zudem, dass ein fehlerhaftes Versandprocedere (z. B. durch mangelhafte Fixation bzw. generell fehlerhafte Präanalytik) zu einem immer bestehenden Restrisiko in der Untersuchung führt, welches zu einer Einschränkung der diagnostischen Beurteilung führen kann, diese gelegentlich auch unmöglich macht.
Das NGS-Labor des Institutes hat zudem seit 2019 begonnen, ein Qualitätsmanagement aufzubauen, dass die Kriterien der Internationen Normen DIN EN ISO/IEC 17020:2012 erfüllt. Nach erfolgreich bestandenem, fachbezogenem Prüfprozess wurde das Institut für Gewebediagnostik am 24.02.2022 offiziell gemäß der DIN EN ISO/IEC 17020 als Inspektionsstelle vom Typ C durch die Deutsche Akkreditierungsstelle DAkkS akkreditiert und erhielt die Akkreditierungsurkunde (D-IS-20295-01-00) als Kompetenzbestätigung (Akkreditierte Stelle - DAkkS - Deutsche Akkreditierungsstelle GmbH)
Anforderungsschein NGS- und PCR-Labor Molekularpathologie
Die molekularpathologische Analyse von Untersuchungsmaterial aus dem Blut oder anderen Körperflüssigkeiten wird unter dem Begriff Liquid Biopsy zusammengefasst. Hierbei wird frei zirkulierende DNA gewonnen, die häufig aus nur wenigen Molekülen besteht. Es ist die besondere Herausforderung der Liquid Biopsy, diese Moleküle zu isolieren und zu konservieren, um sie dann mit hochsensitiven Methoden (NGS, clamped Real-Time PCR, ddPCR u.a.) in ihren klinisch relevanten Genabschnitten molekularbiologisch zu analysieren.
Um für jeden Patienten/jede Patientin mit diagnostiziertem Lungenkrebs eine individualisierte Therapie zu ermöglichen, wird in unserem Hause von jedem nichtkleinzelligen Lungenkarzinom ein biologisches Profil erstellt. Dies geschieht anhand von DNA/RNA -Analysen des Tumors. Weist der Tumor ganz spezielle Mutationen auf, gibt es häufig die Möglichkeit, die z.T. sehr nebenwirkungsreiche Chemotherapie durch zielgerichtete Therapieansätze, z.B. mit Tyrosinkinasehemmern zu ersetzen.
Die Tumor-DNA konnte bisher nur aus Gewebe gewonnen werden. Jüngst gelingt dies aber auch über eine einfache Blutentnahme oder sogar aus anderen Körperflüssigkeiten wie freier Flüssigkeit in der Brust- oder Bauchhöhle (Liquid Biopsy).
Dabei wird aus der Flüssigkeit frei zirkulierende Tumor-DNA (ct-DNA) gewonnen: Die sog. ct-DNA sind kurze Genabschnitte, die von Krebszellen ins Blut freigesetzt werden. Trotz sehr geringer ctDNA Konzentrationen und deren kurzer Halbwertszeit, ist inzwischen eine zuverlässige Gewinnung kleinster im Pikogramm-Bereich liegenden intakten DNA Mengen möglich. Vorteilhaft ist diese minimalinvasive Genanalyse des Tumorgewebes vor allem bei Patient:innen, bei denen eine normale Gewebeprobeentnahme nicht möglich ist, z.B. wenn das Tumorgewebe nur schwer zugänglich ist oder eine konventionelle Biopsie als zu belastend für die Patient:innen eingeschätzt wird. Zudem stellt eine Blutentnahme im Rahmen von „Tumor Monitoring“ eine einfach durchzuführende und für Patient:innen wenig beeinträchtigende alternativ mögliche Untersuchungsmethode dar.
MUTATIONSANALYSE AUS LIQUID BIOPSY MITTELS NGS ODER REAL-TIME PCR
Aufgrund der sehr geringen ct-DNA Mengen im Blut, gelingt die Mutationsanalyse aus zellfreier Tumor DNA nur mit äußerst sensitiven und speziell für diese Extraktion weiterentwickelten Amplifikationsverfahren: Dies ist durch die hoch sensitive Analyse mittels Next Generation Sequencing möglich, welche wir bei uns inzwischen in der Routine Diagnostik anbieten. Darüber hinaus haben wir in-house PCR-Assays entwickelt, welche speziell für die schnelle Detektion der Einzelmutation T790M und der L858R im EGFR Gen aus dem Blut oder anderen Körperflüssigkeiten außer Urin eingesetzt werden.
Einsendung für die molekularbiologische Analyse mittels NGS und PCR
- Eine Analyse aus Liquid Biopsy kann ausfolgenden Nativmaterialen erfolgen:
- Blut (in EDTA- oder PaxGene-Röhrchen; mind. 10ml Vollblut; Information für Einsender (PDF) beachten)
- Liquor (in sterilen nuklease-freie Röhrchen; mind. 6ml)
- Pankreaszystenflüssigkeit (in sterilen nuklease-freie Röhrchen; mind. 4ml)
- Aszites (in sterilen nuklease-freie Röhrchen; mind. 4ml)
- Pleurapunktat (in der Entnahmespritze; mind. 6ml)
- Der Transport bzw. die Abnahme der Proben erfolgen wie folgt:
- Nur nach telefonischer Ankündigung (s. Anforderungsschein (PDF).
- Nur mit einem Kurierdienst und nicht auf dem Postweg, da die Proben schnellstmöglich im Labor verarbeitet werden müssen.
- Ohne Kühlung der Proben, d.h. bei Raumtemperatur.
- Nicht an einem Freitag bzw. vor einem Feiertag, da das Labor an Feiertagen und am Wochenende nicht besetzt ist.
Bitte beachten Sie zudem, dass ein fehlerhaftes Versandprocedere (z. B. durch Verwendung falscher oder abgelaufener Blut-Röhrchen bzw. generell fehlerhafte Präanalytik) zu einem immer bestehenden Restrisiko in der Untersuchung führt, welches zu einer Einschränkung der diagnostischen Beurteilung führen kann, diese gelegentlich auch unmöglich macht.
Das NGS-Labor des Institutes hat zudem seit 2019 begonnen, ein Qualitätsmanagement aufzubauen, dass die Kriterien der Internationen Normen DIN EN ISO 15189:2014 erfüllt. Nach erfolgreich bestandenem, fachbezogenem Prüfprozess wurde das Institut für Gewebediagnostik am 29.08.2022 offiziell gemäß der DIN EN ISO 15189 durch die Deutsche Akkreditierungsstelle DAkkS akkreditiert und erhielt die Akkreditierungsurkunde (D-ML-20295-02-00) als Kompetenzbestätigung (Akkreditierte Stelle - DAkkS - Deutsche Akkreditierungsstelle).
Anforderungsschein NGS-Labor Molekularbiologie
Informationen für Einsender: Blutentnahme und Probenversand
Aktuelle Liste der Untersuchungsverfahren im flexiblen Akkreditierungsbereich ML-20295-02
2023 - EGFR Exon 20 Insertionen Liquid Biopsy
2024 - ESR1 Mutationsanalyse Liquid Biopsy
IHC Labor
Wir führen immunhistochemische Untersuchungen von Geweben durch.
Genexpressionsanalysen bei Mammakarzinom
- Genexpressionsanalysen
Genexpressionsanalysen haben zur Prognoseabschätzung und Therapieplanung bei Brustkrebspatientinnen zunehmend an Bedeutung gewonnen. Sie schätzen die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines Wiederauftretens des Tumors (Fernrezidiv) innerhalb eines 10-Jahreszeitraumes ein und treffen direkt (1,2) oder indirekt eine Aussage über den zu erwartenden Nutzen einer zusätzlichen Chemotherapie. (3)
Insbesondere Patientinnen mit Hormonrezeptor-positiven, Her-2-negativen Tumoren im Frühstadium und mit bis zu drei befallenen Lymphknoten stehen gemeinsam mit ihren behandelnden Ärzten vor der Entscheidung, postoperativ eine endokrine Therapie allein oder eine zusätzliche Chemotherapie durchzuführen und hier den potentiellen Nutzen der Therapie gegen die Chemotoxizität aufzuwiegen. Genexpressionsanalysen können diese Entscheidung unterstützen und sind daher in allen wichtigen Leitlinien zur Behandlung des Mamma-karzinoms vertreten: AGO, ESMO, Consensus Guidelines von St. Gallen, ASCO, NCCN, NICE.
1. Paik S, Tang G, Shak S et al.: Journal of Clinical Oncology 2006.
2. Albain K, Barlow WE, Shak S et al: Lancet Oncol 2010.
3. Filipits M, Rudas M, Jakesz R et al.: Clin Cancer Res. 2011.
Für HR-pos. und Her2-neg. Brustkrebspatientinnen im frühen Stadium bieten wir die Durchführung des EndoPredict-Testes (EP/EPclin) an.
Der von der Firma Sividon in Köln entwickelte und von Myriad vertriebene EndoPredict® (EP/EPclin) wird als In-House Black-Box-Test in unserem molekularpathologischen Labor durchgeführt. Acht Gene und 3 Kontrollgene werden mittels RT-PCR untersucht und mit zwei klinischen Parametern (Tumorgröße und Nodalstatus) zu einem Scorewert kombiniert (EP/EPclin-Score). Der Test wurde aus über 900 Hormonrezeptor-positiven und Her-2-negativen archivierten Tumorproben entwickelt und in zwei Kohorten, der ABCSG-6 (n=378) und der ABCSG-8 (n=1324) validiert.(*) Die Testdurchführung dauert 3-4 Werktage.
Anforderung:
Ein Paraffinblock mit ausreichend invasivem Tumorgewebe aus dem Primärtumor.
Patientenunterlagen (Bestellformular, Ärztliche Begründung, Einwilligung der Patientin, Abtretungserklärung, Antrag Kostenübernahme, Histologischer Befund).
*Filipits M, Rudas M, Jakesz R et al.: Clin Cancer Res. 2011.
In-situ-Hybridisierung
- IHS
In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine molekularbiologische Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Sequenz im Genom der Probe bindet (Hybridisierung).
Die Markierung der Sonde erfolgt bei der FISH direkt mit fluoreszierenden Molekülen. Die Fluoreszenzsignale lassen sich mit Hilfe eines spezifischen Mikroskops in Projektion auf die Zellkerne im geweblichen Zusammenhang auswerten. Ein Farbstoff markiert dabei das Zielgen, ein anderer das Zentromer des zugehörigen Chromosoms. So lassen sich Genbrüche, Genamplifikationen oder Deletionen gezielt nachweisen und quantifizieren.